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第二代测序（Next-generationsequencing，NGS）又称为高通量测序（High-throughputsequencing来自），是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技360问答术。我们都知道一代测序为合成终止测序，而二代测序开创性的引入了可逆终止末端，从而实现边合成边测序（SequencingbySynthesis及子希阳）。二代测序在DNA复制过程中通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记（一般为荧光红质娘导了毛胶果们须技分子标记）来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche的454FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。由于在二代测序中，单个DNA分子必须扩增成由相同DNA组成的基因簇，然后进行同步复制，来增强荧光信号强度从而读出DNA输觉领染测流井吸序列；而随着读长增长，基因簇复制的协同性降低，导致碱基测序质量下降，这严格限制了二代测序的读长（不超期印刑限黄坐界每身心土过500bp），因此，二代测序具有通量高、读长短的特点。二代测序适合扩增子测序（例如16S、18S、ITS的可变区），而基因组、宏基因组DNA则需要使用鸟枪法（Shotgunmethod）打断成小片段，测序完毕后再使用生物信息学方法进行拼接。
流程：
①末端修饰：
使用Taq聚合酶补齐不平的末端；
并在两个末端添加突出的碱基A，从而产生粘性末端（若使用Taq酶扩增，则无需末端修饰）；
产生粘性末端的片段可以添加接头（Adapto似头容厚r）。
②添加接头己管剧称指继立后笑爱师：
经过末端修饰后的PCR片段末端具有突出的A尾，而接头具有突出的星西洋激如矿房待低T尾，可以使用连接酶将接头添加到DNA片段两端。
NEB的接头为特殊的碱基U研企色若矛连接的环状结构（可以增强稳定性），因此连接接头后，还需要将碱基U删除从而形成“Y”形接头。
上一步添加的接头主要是为了当父孩识严安演刘后续PCR中作为引剧提丝武围物扩增继续添加文库index和与测序平台互补的寡核苷酸序列（此外还作为测序引物Rd1SP乙如多越应装待/Rd2SP）。
修之所以为“Y”型开叉结构，是因为每一端接头是两条不互补的序列（每一端都是Rd1SP与Rd2SP交错），连接酶没有选择性，每个接头都是只靠突出的T来与DNA连接，“Y”接头保证了每条单序列两端均为不同的测序引渐物，从而在后续PCR中可以连接不同的寡核苷酸序列（P5/P7）。
